细胞表型实验
前提：设计实验组和对照组
目的：研究肿瘤细胞表型特征或在特定情况下（相关基因或蛋白改变）肿瘤细胞的表型变化。
内容：细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、迁移、趋化、增殖、生长等。
1.细胞凋亡
Ø 概念：是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。
Ø 实验方法：检测试剂盒和细胞流式。
Ø 注意点：进行细胞凋亡实验时，要用不含EDTA的胰酶进行消化。
磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可以从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露
在细胞外环境。Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin V进行荧光
素FITC标记可以用流式细胞仪进行检测。胰酶中的EDTA能够螯合钙离子，从而削弱Annexin V结合效率，对凋亡实验
造成不可控影响。因此实验时，需要另外购买不含EDTA的胰酶，不能直接使用实验室现有的胰酶。
2.细胞迁移
Ø 目的：测定肿瘤细胞的运动特性方法之一。
Ø 原理：体外培养单层细胞，人为制造空白区域——“划痕”，细胞逐渐进入空白区使划痕愈合。
Ø 实验方法：
1） 培养板接种细胞之前先用marker笔在培养板背面画横线标记（方便定位同一个视野）。
2） Day1, 种板，数量以贴壁后铺满板底为宜（也可在划痕前做其它处理如转染、感染）。
3） Day2，细胞铺满板底后，用10ul枪头比着直尺，垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。
4） 用PBS冲洗孔板三次，去除划痕产生的细胞碎片，加入有血清/无血清培养基。
注意点：
² 根据不同细胞系的贴壁情况，选择是否立刻用PBS清洗。例如转染后的huh7细胞系划痕后易飘起。
² 关于有血清/无血清培养基的选择：当划痕实验周期比较短的时候（小于48h），或者不考虑增殖对实验造成的影响，
可以用有血清培养基培养。当划痕实验周期比较长的时候，用无血清或者低血清或者用放线菌酮抑制细胞增殖。
5） 将培养板放入培养箱培养，每隔8-12小时（至少一天2次）取出拍照。
例如RBE细胞隔6小时拍照，拍照间隔和拍照时间要根据不同细胞系决定。
6） 根据收集的图片，分析实验结果，将实验结果量化。
Note：用AI量化结果，建议比较划痕间的距离而非面积。
3.细胞生长和增殖
克隆形成
Ø 克隆的概念：单个细胞在体外增殖6代以上（>1week），其细胞形成的细胞群体。
Ø 目的：克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。（贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。）
Ø 实验方法：
1） 取对数期生长的细胞，计数种板。
2） 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时(3mm)，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加甲醇固定15分钟。然后
去固定液，加适量结晶紫染色液染色约15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
Note：细胞增殖慢且细胞数少时，注意补液，如huh1，培养一周后换液。
3） 拍照定性定量，注意评估染色后的细胞克隆与细胞碎片。
Note：
² 判定是否为克隆，形状规整，大小大于一个定值。
² 克隆形成因为细胞数目少，生长速度慢，缺乏群体效应，不能按照平时传代速度计算细胞形成克隆后的大小。
² 克隆大小有差异，可能是由于细胞本身的干性或者受到外界损伤差异。
MTT
Ø 目的：检测细胞存活和生长。
Ø 原理：活细胞中的酶能够还原外源的MTT，使其沉积在细胞中，通过加入DMSO溶解检测570nm波长（根据购买的MTT选定）的吸光值，间接反映活细胞数量。
Ø 实验方法：
1） 以96孔板为例，液封边缘孔，选择适合的细胞数种板，种5个复孔。
2） 每天同一个时间点，加入MTT（避光，1:10/well添加），4h后加入DMSO，在摇床上使有色物质充分溶解，然后测定
570nm处的吸光值。
4.悬浮小球sphere formation assay
Ø 目的:反映肿瘤细胞的干性特征，能够判断单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力。
Ø 实验方法：
1） 根据所选的细胞计数，确保形成单细胞悬液，种到低附板中（6孔板，完全培养基）。
2） 培养10-12天后，计数（前5天勿移动、勿更换培养基，可以补液）。
Note：ICC细胞系中RBE和HUCCT1不成球。
5.细胞侵袭
Ø 目的：分析细胞的运动能力。
Ø 原理：Matrigel人造基质膜。滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现
出较好的相关性。
在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上层种肿瘤细胞，下层加FBS或实验设定的药物或者影响因子，肿瘤
细
胞在侵袭能力较强的情况下，会分泌相关的酶类消化基质胶，从上室迁移到下室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞
的
侵袭能力。
细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，
然后固定染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。（侵袭小室不止transwell）
Ø Transwell原理：将小室放入培养板中，小室内称上室（free FBS），培养板内称下室(根据细胞转移力调整FBS浓度)，
上下层培养液以膜相隔，并在膜上室铺基质胶，用来模拟体内细胞外基质，如果上室的细胞要转移到下室，需要分泌基
质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，才能通过膜，最后通过计数下室的细胞量可反映细胞的侵袭能力，如下图：
Ø 视频：https://www.biomart.cn/experiment/430/488/490/705/206556.html
Ø 应用：
1) 不铺基质胶，Transwell可用于细胞迁移实验。
2) 可用于细胞共培养（研究细胞分泌或代谢物对另一细胞的影响）。
3) 趋化性实验（在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。）
6.细胞共培养
目的：模拟多细胞相互作用。
1） 直接接触共培养：要求生长特征一致的细胞一起培养。
2） 间接接触共培养：
² 爬片式：将细胞先接种到处理的玻片上，贴壁后，放入到另一种细胞的培养皿与其共培养。爬片步骤：
https://wenku.baidu.com/view/916c27baaf1ffc4fff47ac20.html?rec_flag=default&sxts=1580889298279
² 嵌入式：（Transwell共培养）小室铺上PC或PET膜，孔径小于3.0um,一般为0.4um， 细胞不能通过此膜，但是细胞
因子等能够自由通过。l
Note：
² THP1作为悬浮细胞可以直接与贴壁HCC细胞共培养；
² 利用Polyester (PET) Membrane Tissue Culture Plate Insert with 0.4 μm pores (JET biofil)的6孔板，
类似上下两室分别种需要的细胞，数目1:1（约12-15万细胞数目）共培养后，可以提取RNA或蛋白，检测相关基
因；或共培养48-72h，用于表型实验。
