2019年12月16日，我院郭行实验室在PNAS杂志发表了题为“Reversible phosphorylation of Rpn1 regulates 26S proteasome assembly and function”的研究论文。首次揭示了Rpn1-Ser361位点的动态磷酸化调控蛋白酶体前体的组装，最终影响了其功能的详细分子机制。

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system (UPS)）负责选择性的降解真核细胞中大部分蛋白质。蛋白酶体参与细胞周期，线粒体代谢等各种各样的生命活动，在调控细胞内蛋白质组动态平衡上发挥着重要作用。蛋白酶体功能异常和多种疾病，比如多发性骨髓瘤，阿尔兹海默症等密切相关。蛋白酶体的各个亚基在分子伴侣的参与下逐步组装，最终形成如下类似于筒状的结构（图A），功能上分成 RP和CP两部分。RP主要负责识别和去折叠底物，打开20S，介导底物进入20S。CP主要负责降解蛋白质。蛋白酶体自身还会受到各种各样的翻译后修饰，比如泛素化，磷酸化，肉豆蔻酰化等。质谱数据表明，蛋白酶体表面有四百多个磷酸化位点，但超过90%的位点尚未被研究。Rpn1作为RP上的一个亚基，是泛素和类泛素结构蛋白的受体，其上有一个进化上保守的位点Ser361，该位点的磷酸化被质谱检测到的频率排前十，但其功能一直没有被研究。那么，Rpn1-Ser361的磷酸化究竟具有怎样的生物学功能呢?

该研究利用 CRISPR/Cas9的方法对细胞基因组Rpn1-Ser361进行编辑，得到无磷酸化修饰的Rpn1-Ala361敲入细胞。失去磷酸化的细胞中，蛋白酶体降解活性被下调，且蛋白酶体自身的组装也被破坏了。另外，质谱数据和生化实验都表明，knock-in细胞的线粒体功能异常。该工作还筛选出 Rpn1-Ser361的激酶是 PIMs等，且蛋白酶体的降解活性在PIMs敲除的细胞里是被抑制的；又找出该位点的磷酸酶是UBLCP1（ubiquitin-like domain containing CTD phosphatase 1）。为了探寻磷酸化的Ser361调控蛋白酶体的分子机制，引入非天然氨基酸系统，纯化出 361位磷酸化的Rpn1。通过体外结合实验，证明361位点磷酸化的 Rpn1会增强和Rpt2的结合，从而形成更多蛋白酶体的前体结构“base”，进而组装出更多成熟的26S蛋白酶体（图B）。

该研究第一次从分子水平详细阐明了一个磷酸化位点如何调控蛋白酶体前体的组装；最终影响成熟蛋白酶体的功能，并且找到了它的激酶和磷酸酶。该成果对于理解蛋白酶体这样一个多蛋白复合物的组装和功能调控有着重要的启示作用，也使我们对蛋白酶体翻译后修饰的认识又加深了一步。蛋白酶体抑制剂已经在癌症治疗中发挥重要作用，但针对蛋白酶体的激活剂尚缺乏研究。该研究发现的激酶PIMs可为研发针对蛋白酶体的激活剂提供新的途径。

郭行课题组博士研究生刘晓妍和北京蛋白质组研究中心（BPRC）徐平课题组博士研究生肖伟弟为文章的共同第一作者，郭行教授是该论文的通讯作者。该课题得到了国家自然科学基金面上项目，浙江省自然科学基金，浙江大学启动基金等基金的资助。

原文链接：https://www.pnas.org/content/early/2019/12/13/1912531117/tab-figures-data